Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria: diferenças entre revisões
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# Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos ''eppendorf'' marcados (1 e 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mL de Taq e 900 mL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800μL); |
# Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos ''eppendorf'' marcados (1 e 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mL de Taq e 900 mL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800 μL); |
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# Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos ''eppendorf'' marcados (3, 4 e 5) a partir de 500 |
# Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos ''eppendorf'' marcados (3, 4 e 5) a partir de 500 μL da diluição de 1000X e 500 μL de tampão de diluição 1X; |
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# Colocar 20 |
# Colocar 20 μL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10X; 50X; 100X; 200X; 400X (5 tubos); |
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# Adicionar 20 |
# Adicionar 20 μL de PCR ''MasterMix'' a cada tubo de PCR; |
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# Colocar os tubos em gelo; |
# Colocar os tubos em gelo; |
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# Depois de agitadas no ''vortex'', as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na tabela abaixo; |
# Depois de agitadas no ''vortex'', as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na tabela abaixo; |
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# Durante o tempo de espera, desenhar no computador os ''primers'' necessários para amplificar o gene GFP; |
# Durante o tempo de espera, desenhar no computador os ''primers'' necessários para amplificar o gene GFP; |
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# Misturar 5 |
# Misturar 5 μL de produto de PCR com 5 μL de tampão de aplicação; |
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# Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%; |
# Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%; |
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# O instrutor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência; |
# O instrutor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência; |
Revisão das 12h01min de 22 de fevereiro de 2008
acima: ÍNDICE
- Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos eppendorf marcados (1 e 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mL de Taq e 900 mL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800 μL);
- Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos eppendorf marcados (3, 4 e 5) a partir de 500 μL da diluição de 1000X e 500 μL de tampão de diluição 1X;
- Colocar 20 μL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10X; 50X; 100X; 200X; 400X (5 tubos);
- Adicionar 20 μL de PCR MasterMix a cada tubo de PCR;
- Colocar os tubos em gelo;
- Depois de agitadas no vortex, as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na tabela abaixo;
- Durante o tempo de espera, desenhar no computador os primers necessários para amplificar o gene GFP;
- Misturar 5 μL de produto de PCR com 5 μL de tampão de aplicação;
- Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%;
- O instrutor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência;
- Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts;
- Fotografar o gel;
- Comparar o rendimento do PCR com o rendimento obtido com a Taq polimerase comercial;
- Calcular o número de unidades na preparação.
Condições do PCR
Temperatura | Duração | Fase |
94 ºC | 120 seg | Desnaturação inicial |
94 ºC | 20 seg | Desnaturação |
40 ºC | 20 seg | Emparelhamento |
72 ºC | Taq = 20 seg e Pfu= 1 min 45 seg | Elongamento |
72 ºC | 120 seg | Elongamento final |