Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante

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Micrografia electrónica a baixa temperatura de um agregado de bactérias Escherichia coli (amplificação: 10000X).
Micrografia electrónica de bactérias Escherichia coli.
Comparação da actividade de plasmídeos não-integrativos (acima da linha) com epissomas (abaixo da linha), durante a divisão celular. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico e plasmídeos dividindo-de em duas bactérias idênticas, cada uma com o seu DNA cromossómico e plasmídeos. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico, mas com um epissoma. A seguir, observa-se a mesma bactéria após integração do epissoma no DNA cromossómico. Esta bactéria divide-se em duas bactérias idênticas, cada uma com o epissoma integrado no seu genoma.

Dia 1[editar | editar código-fonte]

  • Inocular 4 mL de meio LB amp com Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
  • Incubar a 37 °C, com agitação.

Dia 2[editar | editar código-fonte]

  • Inocular 200 mL de SuperBroth com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37°C, com agitação;
  • Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37°C, com agitação.

Dia 3[editar | editar código-fonte]

  • Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
  • Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 °C);
  • Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de tampão A;
  • Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4°C);
  • Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg lisozima (concentração final = 4 mg/mL);
  • Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
  • Adicionar 2 mL de tampão B com PMSF (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
  • No gelo, guardar ≈0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 1;
  • Incubar a 75 °C, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
  • Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 °C);
  • Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos eppendorf;
  • Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4°C);
  • Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
  • No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 2;
  • Misturar com igual volume (≈4 mL) tampão Storage com 50 % de glicerol;
  • Misturar com igual volume (≈8 mL) tampão Storage com 75 % de glicerol;
  • O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;
  • Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 °C (para usar na próxima etapa).

Soluções[editar | editar código-fonte]

  • Superbroth: (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro.
  • Tampão A: 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM dextrose + 1 mM EDTA.
  • Tampão B: 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM KCl + 1 mM EDTA + 0.5% Tween 20 (1%) + 1 mM PMSF.
  • Tampão Storage: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol.