Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante

Micrografia electrónica a baixa temperatura de um agregado de bactérias Escherichia coli (amplificação: 10000X).

Micrografia electrónica de bactérias Escherichia coli.

Comparação da actividade de plasmídeos não-integrativos (acima da linha) com epissomas (abaixo da linha), durante a divisão celular. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico e plasmídeos dividindo-de em duas bactérias idênticas, cada uma com o seu DNA cromossómico e plasmídeos. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico, mas com um epissoma. A seguir, observa-se a mesma bactéria após integração do epissoma no DNA cromossómico. Esta bactéria divide-se em duas bactérias idênticas, cada uma com o epissoma integrado no seu genoma.

Dia 1

• Inocular 4 mL de meio LB amp com Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
• Incubar a 37 °C, com agitação.

Dia 2

• Inocular 200 mL de SuperBroth com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37°C, com agitação;

• Quando a Densidade Óptica (λ=600 nm) ≈0.4, adicionar 0.4 mL IPTG 1M (concentração final = 2 mM);

• Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37°C, com agitação.

Dia 3

• Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
• Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 °C);

• Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de tampão A;

• Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4°C);

• Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg lisozima (concentração final = 4 mg/mL);

• Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;

• Adicionar 2 mL de tampão B com PMSF (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);

• No gelo, guardar ≈0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 1;

• Incubar a 75 °C, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;

• Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 °C);

• Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos eppendorf;

• Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4°C);

• Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;

• No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 2;

• Misturar com igual volume (≈4 mL) tampão Storage com 50 % de glicerol;

• Misturar com igual volume (≈8 mL) tampão Storage com 75 % de glicerol;

• O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;

• Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 °C (para usar na próxima etapa).

Soluções

• Superbroth: (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro.

• Tampão A: 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM dextrose + 1 mM EDTA.

• Tampão B: 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM KCl + 1 mM EDTA + 0.5% Tween 20 (1%) + 1 mM PMSF.

• Tampão Storage: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol.