Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria

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1. Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos Eppendorf (marcados 1 a 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 ml Taq e 900 ml de tampão dilution 1X e depois 5X (200 uL800uL).

2. Fazer 3 diluições de 2X sucessivas em 3 tubos Eppendorf (marcados 3 a 5) a partir de 500 ml da diluição de 1000X e 500 ml de tampão dilution 1X.

3. Adicionar 20 ml das diluições a cada tubo de PCR (10X; 50X; 100X; 200X; 400X) (5 tubos).

4. Adicionar 20 ml da PCR Master Mix a cada tubo de PCR

6. Colocar os tubos em gelo.

7. As misturas, depois de agitadas no vortex, são sujeitas a PCR nas seguintes condições:

120 segundos, 94C (desnaturação inicial) 20 segundos, 94C (desnaturação) 20 segundos, 40C (emparelhamento) 20 segundos (Taq) ou 1min 45s (Pfu) , 72C (enlongamento) 120 segundos, 72C (enlongamento final)

Esta sequência é repetida 30 vezes

8. Durante o tempo de espera, desenhar no computador os primers necessários para amplificar o gene GFP.

9. Misturar 5 ml de produto de PCR com 5 ml de tampão de aplicação.

10. Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%.

11. O instructor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência.

12. Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts.

13. Fotografar o gel.

14. Comparar o rendimento do PCR com o rendimento obtido com a Taq polímeras comercial.

15. Calcular o número de unidades na preparação.