Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria

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Preparação das soluções para PCR

Conjunto de oito tubos de PCR, cada um contendo 100μL.

• Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos eppendorf marcados, fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 μL de Taq e 900 μL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800 μL);

• Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos eppendorf marcados, a partir de 500 μL da diluição de 1000X e 500 μL de tampão de diluição 1X;

• Colocar 20 μL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10x, 50x, 100x, 200x e 400x (5 tubos);

• Adicionar 20 μL de PCR MasterMix a cada tubo de PCR;

• Colocar os tubos em gelo;

Preparação de soluções de DNA polimerase com diferentes concentrações, através da técnica de diluições seriais, para amplificação em PCR. Os factores de diluição correspondentes a cada solução estão representados nos rótulos dos respectivos eppendorfs. Pipetaram-se 100μL da solução inicial (1x) para o 1º eppendorf e adicionaram-se 900μL de Tampão de Diluição. Agitar a solução. Desta solução (10x) pipetaram-se 200μL para o 2º eppendorf e adicionaram-se 800μL de Tampão de Diluição. E assim sucessivamente, como descrito na figura, sempre de modo a perfazer 1mL de volume final no eppendorf. De todos esses eppendorfs retiraram-se 20μL aos quais se adicionou igual volume de Mastermix. Agitar as soluções. Inserir no termociclador, para realizar o PCR.

• Depois de agitadas no vortex, as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na

tabela abaixo.

Condições do PCR

Ficheiro:Pcr machine.jpg

Aparelho de PCR (termociclador).

Temperatura	Duração	Fase
94 ºC	120 seg	Desnaturação inicial
94 ºC	20 seg	Desnaturação
40 ºC	20 seg	Emparelhamento
72 ºC	Taq = 20 seg e Pfu= 1 min 45 seg	Elongamento
72 ºC	120 seg	Elongamento final

Esta sequência é repetida 30 vezes.

Análise Electroforética dos produtos de PCR

• Misturar 5 μL de produto de PCR com 5 μL de tampão de aplicação;

• Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%;

• O instrutor efectua a electroforese com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência;

• Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts;

• Fotografar o gel.

Aparelho de Electroforese em gel. O gel de agarose é colocado nesta caixa com solução tampão e a corrente eléctrica é-lhe aplicada. O terminal negativo está no topo (fio preto), então o DNA migra em direcção ao observador.

Representação esquemática do processo de electroforese, detalhando as sucessivas etapas. (1) Gel de agarose com três poços. (2) Injecção da solução padrão de DNA marcadora de pesos moleculares, no primeiro poço. (3) Após o padrão estar injectado, injectam-se as amostras no segundo e terceiro poços. (4) Aplica-se uma corrente eléctrica que provoca a migração do DNA para o pólo positivo, devido à carga negativa conferida pelo esqueleto fosfatado. (5) As cadeias de DNA pequenas migram mais rapidamente, por outro lado, as maiores migram mais lentamente através do gel; normalmente, durante este processo, o DNA não é visível, por isso adiciona-se ao DNA um corante ou marcador para evitar que o DNA migre para fora do gel. (6) Adicionar o corante ou marcador também ao padrão de DNA.

Actividades propostas

• Comparar o rendimento do PCR obtido com o da Taq polimerase comercial.

• Calcular o número de unidades na preparação.