Engenharia genética/As DNA polimerases Taq e Pfu

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Considerações iniciais[editar | editar código-fonte]

Estrutura tridimensional de parte da enzima DNA polimerase.

Um grande número de DNA polimerases de seres termófilos e hipertermófilos têm sido isoladas e caracterizadas de archaea e eubacterias termófilas.

Estas enzimas têm atividade a uma temperatura ótima elevada e têm uma estabilidade térmica que corresponde aos ambientes térmicos extremos onde os organismos vivem.

Apesar do facto de a estabilidade térmica das proteínas nativas variar entre as diversas enzimas, existe uma temperatura ótima de polimerização comum entre os 70 e os 80ºC.

Isto sugere que a estabilidade do template, contrastando com a estabilidade intrínseca das enzimas, determina a temperatura da polimerização.

Devido à termoestabilidade destas enzimas, as relações entre a estrutura e função, e as potenciais aplicações biotecnológicas de muitas destas enzimas termoestáveis, tal como as DNA polimerases, são de grande interesse para a investigação científica.


Fotografia de Thermus aquaticus‎ obtida por microscopia electrónica.

Taq DNA polimerase[editar | editar código-fonte]

A Taq DNA polimerase é proveniente da bactéria termófila Thermus aquaticus, sendo a enzima de eleição para a maioria das aplicações de PCR (Polymerase Chain Reaction). A Taq DNA polimerase consiste numa cadeia polipeptídica simples, com um peso molecular de aproximadamente 95 kD e com uma temperatura ótima de atividade de 75 ºC. Esta DNA polimerase catalisa a síntese do DNA de 5'-3'. Por outro lado, de 3'-5' não tem atividade exonucleásica e de 5'-3' esta é baixa. A enzima é obtida a partir de células de Escherichia coli nas quais está clonado o gene poI de Thermus aquaticus. Através da técnica de PCR, a Taq polimerase é usada para amplificar fragmentos de DNA tão grandes como 5 Kb e apresenta uma taxa de erro de 2.2x10-5 nucleótidos por ciclo.


Representação esquemática simplificada do processo de Iniciação da Transcrição.
Representação esquemática simplificada do processo de Elongação da Transcrição.
Representação esquemática simplificada do processo de Terminação da Transcrição.


Pfu DNA polimerase[editar | editar código-fonte]

A Pfu DNA polimerase, enzima encontrada no organismo hipertermófilo Pyrococcus furiosus, tem a menor taxa de erro conhecida na amplificação por PCR. Por essa razão, é usada nas aplicações de PCR que exigem grande fidelidade.

A enzima catalisa a incorporação de nucleótidos na direcção 5'-3' na presença de magnésio a 70-80ºC.

Esta é obtida a partir de células de Escherichia coli nas quais está clonado o gene poI de Pyrococcus furiosus.

A Pfu DNA polimerase tem atividade exonucleásica de 3'-5', o que lhe permite corrigir erros introduzidos durante a polimerização. Esta DNA polimerase tem a capacidade de efetuar proofreading, consequentemente, a sua taxa de erro é cerca de 7 a 10 vezes menor do que a da Taq polimerase (esta última não é capaz de efectuar proofreading). Apresenta uma taxa de erro inferior a 2.6x10-6 por nucleótido em cada ciclo.

No entanto, a Pfu tem a desvantagem de ser mais lenta e requerer 1 a 2 minutos para amplificar 1 kb de DNA a 72ºC.

Esta enzima pode aceitar nucleótidos com marcadores fluorescentes como substrato e não tem atividade detectável de transcriptase reversa. Quando utilizada em técnicas de PCR, gera produtos amplificados blunt-end.


Sumário[editar | editar código-fonte]

Para a amplificação de fragmentos de DNA, através do método de PCR, têm sido muito úteis as DNA polimerases Taq e Pfu.

O microrganismo Escherichia coli está geneticamente bem caracterizado, tem crescimento rápido e é de fácil cultivo, consequentemente, apresenta um rendimento significativo na produção destas polimerases.

Neste trabalho, as DNA polimerases foram isoladas a partir de Thermus aquaticus (Taq) e de Pyrococcus furiosus (Pfu) e, posteriormente, foram expressas em E. coli.

Ligações Externas[editar | editar código-fonte]