Engenharia genética/Os vetores do sistema pET

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Considerações iniciais[editar | editar código-fonte]

Representação esquemática da T7 RNA Polimerase (azul) produzindo mRNA (verde) a partir de um template de DNA em dupla cadeia (laranja). Baseado em PDB ID 1MSW

Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vetores pET.

O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes.

Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.

Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência de uma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efetivamente desacoplado do passo de expressão.

O hospedeiro mais comumente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon e ompT.

Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais se salientam a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada atividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.

Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.

Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET[editar | editar código-fonte]

Estirpe Derivação Características Especiais Resistência a Antibióticos Competência das Células
BL21(DE3) B834 Faltam as proteases lon e ompT Cloranfenicol Sim

Vantagens do Sistema pET:[editar | editar código-fonte]

Poderoso:

  • Níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal;
  • Adequação da escolha de vetores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.

Versátil:

Rápido:

Completo:

  • Variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.

Ligações Externas[editar | editar código-fonte]