Engenharia genética/Os vetores do sistema pET
Considerações iniciais
[editar | editar código-fonte]
Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vetores pET.
O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes.
Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.
Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência de uma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efetivamente desacoplado do passo de expressão.
O hospedeiro mais comumente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon e ompT.
Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais se salientam a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada atividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.
Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.
Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET
[editar | editar código-fonte]| Estirpe | Derivação | Características Especiais | Resistência a Antibióticos | Competência das Células |
| BL21(DE3) | B834 | Faltam as proteases lon e ompT | Cloranfenicol | Sim |
Vantagens do Sistema pET:
[editar | editar código-fonte]Poderoso:
- Níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal;
- Adequação da escolha de vetores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
Versátil:
- Escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização;
- Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames;
- Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
Rápido:
- Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados;
- Locais de restrição convenientes para subclonagem de outros vetores;
- Escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.
Completo:
- Variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.