Engenharia genética/Transformação e gap-repair em Saccharomyces cerevisiae

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Protocolo Experimental

Em condições de assepsia:

• Centrifugar, durante 30 segundos, na velocidade máxima, 2 mL de cultura de levedura colocando 1 mL em cada tubo eppendorf;

• Remover o sobrenadante;

• Ressuspender as células em 1 mL de água desionizada;

• Centrifugar os tubos durante 30 segundos, na velocidade máxima;

• Remover o sobrenadante;

• Adicionar 326 μL de mistura de transformação* a cada tubo, e manter em gelo;

• Adicionar 10 μL de vector a cada tubo;

• Adicionar 24 μL de produto de PCR a um dos tubos eppendorf. Marcar esse tubo com o sinal (+);

• Adicionar 24 μL de água desionizada ao outro tubo eppendorf. Marcar esse tubo com o sinal (-);

• Vortexar ambos os tubos durante 60 segundos, no máximo da velocidade;

• Num banho térmico efectuar um choque térmico a 42 ºC, durante 40 minutos;

• Centrifugar os tubos, durante 30 segundos, na velocidade máxima;

• Remover o sobrenadante;

• Adicionar 1 a 2 mL de água desionizada a cada tubo eppendorf;

• Ressuspender as células;

• Plaquear 200 μL de células de cada tubo em placas marcadas (+) e (-);

• Incubar as placas a 30 ºC.

(*) Mistura de transformação:
240 μL PEG (50%, v/v) + 36 μL 1,0 M acetato de Lítio + 50 μL SS-DNA (2,0 mg/mL)

Noções Básicas

O gene GFP vai ser clonado no vector p426GPD. Este vector está descrito por Mumberg et al. (1995) em Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.

Este vector tem um promotor forte de S. cerevisiae que é do gene GPD (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).

Este gene mudou o nome para TDH3.

O terminador é do gene CYC1 (cytochrome C).

Noções Práticas

Nós vamos utilizar uma técnica chamada Gap-repair (Modelo de Recombinação Homóloga).

O Gap-repair é baseado na recombinação entre o fragmento (Gene GFP) e o vector (plasmídeo p426GPD) através de regiões homólogas curtas.

EXEMPLO: Gap-repair com quatro bases de homologia (na realidade precisamos de 30 pb):

Fragmento:   5' - GATCatgttgtaaACGT - 3'
             3' - CTAGtacaacattTGCA - 5'
Vector: 5' - acgagGATC         ACGTagagacagt - 3'
        3' - tgctcCTAG         TGCAtctctgtca - 5'

• Isto significa que é necessário adicionar uma sequência de 30 pb em cada lado do produto de PCR que é homólogo às extremidades do vector. Podemos adicionar esta sequência na extremidade 5’ em cada primer.

• O promotor do TDH3 acaba imediatamente antes do codão de iniciação do gene (ATG). O terminador começa imediatamente depois do codão stop do CYC1 (TAA).

• É necessário saber as sequências do promotor TDH3 e do terminador CYC1:

• A maneira mais fácil de obter sequências de Saccharomyces cerevisiae é através da Saccharomyces Genome Database.

• Aqui pode obter Gene/Sequence Resources qualquer sequência de S. cerevisiae.

• Escreva “TDH3” ou “CYC1” na janela para obter a sequência de cada gene e 30 pb antes ou depois dos genes (Use o link “DNA of region” com o formato GCG).

• Temos a sequência do gene TDH3 com trinta bases antes do gene (promotor) e o gene CYC1 com trinta bases depois (terminador).

• O primer forward necessita de uma região de homologia com os últimos 30 pb do promotor TDH3 e o primer reverse com os primeiros 30 pb do terminador CYC1.

Ligações Externas

In Vivo Ligation of Linear DNA Molecules to Circular Forms in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

HIGH EFFICIENCY TRANSFORMATION

Plasmid construction by homologous recombination in yeast.