Engenharia genética/Desenho dos primers

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Objectivo

• Desenhar os primers necessários para amplificar o gene GFP do vector pUG35.

Vector pUG35

• Encontrar a sequência nucleotídica do vector pUG35.

• Entrar em Entrez, The Life Sciences Search Engine e seleccionar CoreNucleotide.

• Pesquisar "pUG35" e clicar no link “AF298787”.

• O ficheiro então apresentado assenta na seguinte estrutura:

LOCUS: AF298787 6231 bp DNA circular SYN 26-NOV-2000 (Nome curto para esta sequência).

DEFINITION: C-terminal GFP fusion vector pUG35, complete sequence (Definição da sequência).

ACCESSION: AF298787 (Número de acesso de entrada).

VERSION: AF298787.1 GI:11344888 (Versão de entrada).

KEYWORDS: (Palavras-chave da entrada).

SOURCE: C-terminal GFP fusion vector pUG35.

ORGANISM: C-terminal GFP fusion vector pUG35 (O organismo a partir do qual a sequência derivou).

REFERENCE: 1 (bases 1 a 6231)

AUTHORS: Gueldener,U. and Hegemann,J.H. (Autores do trabalho).

TITLE: A second generation of GFP-vectors for subcelluar localization studies in budding yeast (Título da publicação).

JOURNAL: Unpublished (Jornal de referência para a entrada).

...

FEATURES: Location/Qualifiers source 1..6231 /organism="C-terminal GFP fusion vector pUG35" /mol_type="other DNA" /db_xref="taxon:142955" /note="derived from Saccharomyces cerevisiae" gene 417..1220 /gene="URA3" (Características da sequência).

CDS: 417..1220 /gene="URA3" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="orotidine-5'-phosphate decarboxylase" /protein_id="AAG34528.1" /db_xref="GI:11344889" /translation="MSKATYKERAATHPSPVAAKLFNIMHEKQTNLCASLDVRTTKEL LELVEALGPKICLLKTHVDILTDFSMEGTVKPLKALSAKYNFLLFEDRKFADIGNTVK LQYSAGVYRIAEWADITNAHGVVGPGIVSGLKQAAEEVTKEPRGLLMLAELSCKGSLS TGEYTKGTVDIAKSDKDFVIGFIAQRDMGGRDEGYDWLIMTPGVGLDDKGDALGQQYR TVDDVVSTGSDIIIVGRGLFAKGRDAKVEGERYRKAGWEAYLRRCGQQN" terminator 2004..2262 /note="from CYC1" (Sequência codigicante, a parte do gene que codifica para uma proteína).

ORIGIN: 3882..3954 (Início da sequência).

Po fim, apresenta a sequência completa do vector pUG35. Nós queremos apenas a sequência que codifica o gene GFP. Esta informação está em baixo do “FEATURE” no ficheiro:

“CDS” significa “CoDingSequence”. Clique “CDS” para “EGFP3”

Agora vemos só a parte do pUG35 que codifica GFP. Esta sequência deve começar com “atg” e acabar com ”taa”.

Agora, vamos construir primers que vão amplificar o gene GFP inteiro, incluindo codão start e stop, mas nada fora do gene.

As duas cadeias do DNA, denominam-se watson e crick:

Watson 5’-ATG…TAA-3’ Crick 3’-TAC…ATT-5’

O DNA é sempre exibido na forma 5’-3’, e normalmente a cadeia Crick é invisível. Na nossa sequência, só vemos a cadeia Watson.

Precisamos de dois primers para o PCR, um primer forward e um primer reverse. O primer forward vai ligar a cadeia Crick e o primer reverse vai ligar a cadeia Watson.

Queremos uma Tm 49-51C. Um programa denominado “Oligonucleotide properties calulator” pode calcular o Tm.

http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html

Também podem utilizar a seguinte fórmula: Tm = 4×(G+C)+2×(A+T)

Para o primer reverse, usar este site para obter o complemento reverso de uma sequência de DNA: Reverse Complement of Sequence.

A sequência dos primers deve ser descrita no relatório final.

Mais informação sobre desenho de primers.