Engenharia genética/Os vetores do sistema pET: diferenças entre revisões
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== Vantagens do Sistema pET: == |
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*Níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal; |
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*Adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido. |
*Adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido. |
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'''Versátil''': |
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*Escolha das ''tags'' de fusão em [http://en.wikipedia.org/wiki/N-terminal N-terminal] e [http://en.wikipedia.org/wiki/C-terminus C-terminal] para detecção, purificação e localização; |
*Escolha das ''tags'' de fusão em [http://en.wikipedia.org/wiki/N-terminal N-terminal] e [http://en.wikipedia.org/wiki/C-terminus C-terminal] para detecção, purificação e localização; |
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*Existência de [http://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_cloning_site multiple cloning sites] expandidas nas três [http://en.wikipedia.org/wiki/Reading_frame reading frames]; |
*Existência de [http://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_cloning_site multiple cloning sites] expandidas nas três [http://en.wikipedia.org/wiki/Reading_frame reading frames]; |
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*[http://en.wikipedia.org/wiki/Origin_of_replication Origem de replicação] f1 para [http://en.wikipedia.org/wiki/Mutagenesis mutagénese] e sequenciação. |
*[http://en.wikipedia.org/wiki/Origin_of_replication Origem de replicação] f1 para [http://en.wikipedia.org/wiki/Mutagenesis mutagénese] e sequenciação. |
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'''Rápido''': |
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*Sistemas baseados em ''E.coli'' para rápida obtenção de resultados; |
*Sistemas baseados em ''E.coli'' para rápida obtenção de resultados; |
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*[http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_site Locais de restrição] convenientes para [http://en.wikipedia.org/wiki/Subcloning subclonagem] de outros vectores; |
*[http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_site Locais de restrição] convenientes para [http://en.wikipedia.org/wiki/Subcloning subclonagem] de outros vectores; |
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*Escolha de métodos de [http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_purification purificação das proteínas] num passo único sem [http://en.wikipedia.org/wiki/Antibody anticorpos]. |
*Escolha de métodos de [http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_purification purificação das proteínas] num passo único sem [http://en.wikipedia.org/wiki/Antibody anticorpos]. |
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*Variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio. |
*Variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio. |
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== Ligações Externas == |
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Revisão das 12h09min de 26 de fevereiro de 2008
Considerações iniciais
Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET.
O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes.
Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.
Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência de uma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão.
O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon e ompT.
Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais se salientam a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.
Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.
Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET
| Estirpe | Derivação | Características Especiais | Resistência a Antibióticos | Competência das Células |
| BL21(DE3) | B834 | Faltam as proteases lon e ompT | Nenhuma | Sim |
Vantagens do Sistema pET:
Poderoso:
- Níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal;
- Adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
Versátil:
- Escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização;
- Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames;
- Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
Rápido:
- Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados;
- Locais de restrição convenientes para subclonagem de outros vectores;
- Escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.
Completo:
- Variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.
Ligações Externas
pET System Tutorial in Novagen 2002–2003 Catalog
http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/pettablemenued.html pET E. coli T7 expression vectors]