Engenharia genética/Rendimento do PCR

Neste trabalho prático, infelizmente, não nos foi possível amplificar a Pfu DNA polimerase.

Rendimento do PCR usando Taq polimerase comercial vs preparada

Da solução de Taq Comercial (c = 1 U/μL) pipetámos 5 μL (5 U) e diluímos em 100 μL (factor diluição = 20x).

A partir desta solução de Taq pipetámos os volumes indicados nas preparações A a E (tabela 2), aos quais adicionámos diferentes volumes de tampão, perfazendo o volume de 20 μL para todas as preparações. Deste modo, obteve-se um gradiente de concentrações de Taq decrescente de A para E.

A quantidade de Taq (U) presente em cada preparação, corresponde aos valores indicados, 
calculados de acordo com a seguinte relação: (exemplificando para a preparação B)
5 U ----- 100 μL
Q ----- 17 μL                           
Então: Q = 0,85 U

De seguida, adicionou-se igual volume de Mastermix a todas as preparações; como o volume das mesmas duplicou para 40 μL, a concentração de Taq presente em cada preparação corresponde à razão entre a Quantidade (U) e o Volume (40 μL).

O volume de Mastermix adicionado é um parâmetro constante para as diferentes preparações, de modo a que se possam apurar conclusões relativamente à variável em estudo, ou seja, a concentração de Taq DNA polimerase e sua capacidade em realizar efectivamente a Polimerase Chain Reaction obtendo-se, consequentemente, produtos de PCR detectáveis no gel da electroforese.

Como representado na tabela abaixo, detectou-se a presença de produtos de PCR nas preparações A e B.

Preparação e características das soluções (A a E) de diferentes concentrações de Taq DNA polimerase comercial para aplicação no gel electroforético.

	A	B	C	D	E
Volume solução Taq (μL)	20	17	13	7	3
Volume Tampão (μL)	0	3	7	13	17
Quantidade Taq (U)	1	0,85	0,65	0,35	0,15
Volume Mastermix (μL)	20	20	20	20	20
Concentração Taq (U/μL)	2,50x10^-2	2,13x10^-2	1,63x10^-2	8,75x10^-3	3,75x10^-3
Electroforese	+	+	-	-	-