Engenharia genética/Rendimento do PCR

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Neste trabalho prático, infelizmente, não nos foi possível amplificar a Pfu DNA polimerase.


Rendimento do PCR usando Taq polimerase comercial vs preparada[editar | editar código-fonte]

Da solução de Taq Comercial (c = 1 U/μL) pipetámos 5 μL (5 U) e diluímos em 100 μL (factor diluição = 20x).

A partir desta solução de Taq pipetámos os volumes indicados nas preparações A a E (tabela 2), aos quais adicionámos diferentes volumes de tampão, perfazendo o volume de 20 μL para todas as preparações. Deste modo, obteve-se um gradiente de concentrações de Taq decrescente de A para E.

A quantidade de Taq (U) presente em cada preparação, corresponde aos valores indicados, 
calculados de acordo com a seguinte relação: (exemplificando para a preparação B)
5 U ----- 100 μL
Q ----- 17 μL                           
Então: Q = 0,85 U


De seguida, adicionou-se igual volume de Mastermix a todas as preparações; como o volume das mesmas duplicou para 40 μL, a concentração de Taq presente em cada preparação corresponde à razão entre a Quantidade (U) e o Volume (40 μL).

O volume de Mastermix adicionado é um parâmetro constante para as diferentes preparações, de modo a que se possam apurar conclusões relativamente à variável em estudo, ou seja, a concentração de Taq DNA polimerase e sua capacidade em realizar efectivamente a Polimerase Chain Reaction obtendo-se, consequentemente, produtos de PCR detectáveis no gel da electroforese.

Como representado na tabela abaixo, detectou-se a presença de produtos de PCR nas preparações A e B.

Preparação e características das soluções (A a E) de diferentes concentrações de Taq DNA polimerase comercial para aplicação no gel electroforético.[editar | editar código-fonte]
A B C D E
Volume solução Taq (μL) 20 17 13 7 3
Volume Tampão (μL) 0 3 7 13 17
Quantidade Taq (U) 1 0,85 0,65 0,35 0,15
Volume Mastermix (μL) 20 20 20 20 20
Concentração Taq (U/μL) 2,50x10-2 2,13x10-2 1,63x10-2 8,75x10-3 3,75x10-3
Electroforese + + - - -
Resultado da Electroforese em Gel de Agarose de Taq DNA Polimerase (preparada).
Resultado da Electroforese em Gel de Agarose de Taq DNA Polimerase (comercial).