Engenharia genética/Desenho dos primers: diferenças entre revisões
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* '''Nota''': A sequência codificante (CDS) deve começar com |
* '''Nota''': A sequência codificante (CDS) deve começar com “atg” (codão '''''start''''') e acabar com ”'''taa'''” (codão '''''stop'''''). |
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Como pode observar, a sequência apresentada é a da cadeia complementar, de modo que o codão ''start'' está na base (cat ⇒ atg) e o codão ''stop'' está no topo (tta ⇒ taa). |
Como pode observar, a sequência apresentada é a da cadeia complementar, de modo que o codão '''''start''''' está na base (cat ⇒ atg) e o codão '''''stop''''' está no topo (tta ⇒ taa). |
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* Vamos amplificar o gene GFP inteiro, incluindo os codões ''start'' e ''stop'' (mas nada fora do gene). |
* Vamos amplificar o gene GFP inteiro, incluindo os codões ''start'' e ''stop'' (mas nada fora do gene). |
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As duas cadeias do DNA, denominam-se watson e crick: |
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O ''primer '''forward''''' liga-se à cadeia Crick e o ''primer '''reverse''''' liga-se à cadeia Watson. |
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Watson 5’-ATG…TAA-3’ |
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Crick 3’-TAC…ATT-5’ |
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O DNA é sempre exibido na forma 5’-3’, e normalmente a cadeia Crick é invisível. Na nossa sequência, só vemos a cadeia Watson. |
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Queremos uma Tm 49-51C. Um programa denominado “Oligonucleotide properties calulator” pode calcular o Tm. |
Queremos uma Tm 49-51C. Um programa denominado “Oligonucleotide properties calulator” pode calcular o Tm. |
Revisão das 15h01min de 28 de fevereiro de 2008
Objectivo
Conhecer o Vector pUG35
Encontrar a sequência nucleotídica do vector pUG35
- Entrar em Entrez, The Life Sciences Search Engine e seleccionar CoreNucleotide.
- Pesquisar "pUG35" e clicar no link “AF298787”.
- O ficheiro então apresentado assenta na seguinte estrutura:
LOCUS: AF298787 6231 bp DNA circular SYN 26-NOV-2000 (Nome curto para esta sequência).
DEFINITION: C-terminal GFP fusion vector pUG35, complete sequence (Definição da sequência).
ACCESSION: AF298787 (Número de acesso de entrada).
VERSION: AF298787.1 GI:11344888 (Versão de entrada).
KEYWORDS: (Palavras-chave da entrada).
SOURCE: C-terminal GFP fusion vector pUG35.
ORGANISM: C-terminal GFP fusion vector pUG35 (O organismo a partir do qual a sequência derivou).
REFERENCE: 1 (bases 1 a 6231)
AUTHORS: Gueldener,U. and Hegemann,J.H. (Autores do trabalho).
TITLE: A second generation of GFP-vectors for subcelluar localization studies in budding yeast (Título da publicação).
JOURNAL: Unpublished (Jornal de referência para a entrada).
...
FEATURES: Location/Qualifiers (Características da sequência).
source | 1..6231 | |
organism | C-terminal GFP fusion vector pUG35 | |
mol_type | other DNA | |
db_xref | taxon:142955 | |
note | derived from Saccharomyces cerevisiae |
gene | 417..1220 | |
gene | URA3 | |
CDS: | 417..1220 | (Sequência codificante, a parte do gene que codifica para uma proteína) |
gene | URA3 | |
codon_start | 1 | |
transl_table | 11 | |
product | orotidine-5'-phosphate decarboxylase | |
protein_id | AAG34528.1 | |
db_xref | GI:11344889 | |
translation | MSKATYKERAATHPSPVAAKLFNIMHEKQTNLCASLDVRTTKELLELVEALGPKICLLKTHVDILTDFSMEGTVKPLKALSAKYNFLLFEDRKFADIGNTVK
LQYSAGVYRIAEWADITNAHGVVGPGIVSGLKQAAEEVTKEPRGLLMLAELSCKGSLSTGEYTKGTVDIAKSDKDFVIGFIAQRDM GGRDEGYDWLIMTPGVGLDDKGDALGQQYRTVDDVVSTGSDIIIVGRGLFAKGRDAKVEGERYRKAGWEAYLRRCGQQN | |
terminator | 2004..2262 | |
note | from CYC1 |
gene | complement(2271..2987) | |
gene | EGFP3 | |
CDS: | complement(2271..2987) | |
gene | EGFP3 | |
codon_start | 1 | |
transl_table | 11 | |
product | enhanced green fluorescent protein 3 | |
protein_id | AAG34529.1 | |
db_xref | GI:11344890 | |
translation | MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGVQCFARYPDHMKQHDF
FKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRH NIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK | |
promoter | 3051..3443 | |
note | from MET25 | |
rep_origin | 3882..3954 | (Início da sequência) |
- De seguida, encontra-se a sequência completa do vector pUG35.
Encontrar a sequência nucleotídica da CDS do gene GFP
- Para analisar apenas a sequência que codifica o gene GFP, clique em “CDS” para “EGFP3”.
- Ao fundo, encontra a seguinte sequência:
1 ttatttgtac aattcatcca taccatgggt aataccagca gcagtaacaa attctaacaa 61 gaccatgtgg tctctctttt cgtttggatc tttggataag gcagattgag tggataagta 121 atggttgtct ggtaacaaga ctggaccatc accaattgga gtattttgtt gataatggtc 181 agctaattga acagaaccat cttcaatgtt gtgtctaatt ttgaagttaa ctttgatacc 241 attcttttgt ttgtcagcca tgatgtaaac attgtgagag ttatagttgt attccaattt 301 gtgacctaaa atgttaccat cttctttaaa atcaatacct tttaattcga ttctattaac 361 taaggtatca ccttcaaact tgacttcagc tctggtcttg tagttaccgt catctttgaa 421 aaaaatagtt ctttcttgaa cataaccttc tggcatggca gacttgaaaa agtcatgttg 481 tttcatatga tctgggtatc tagcaaaaca ttgaacacca taaccgaaag tagtgactaa 541 ggttggccat ggaactggca atttaccagt agtacaaata aattttaagg tcaatttacc 601 gtaagtagca tcaccttcac cttcaccgga gacagaaaat ttgtgaccat taacatcacc 661 atctaattca accaaaattg ggacaacacc agtgaataat tcttcacctt tagacat
- As duas cadeias do DNA, denominam-se Watson e Crick:
Watson 5’-ATG…TAA-3’ Crick 3’-TAC…ATT-5’
O DNA é sempre exibido na forma 5'-3' por isso, normalmente, a cadeia Crick é invisível.
No entanto, na sequência obtida para o gene GFP, só vemos a cadeia Crick.
- Nota: A sequência codificante (CDS) deve começar com “atg” (codão start) e acabar com ”taa” (codão stop).
Como pode observar, a sequência apresentada é a da cadeia complementar, de modo que o codão start está na base (cat ⇒ atg) e o codão stop está no topo (tta ⇒ taa).
Construir os primers para amplificar o gene GFP
- Vamos amplificar o gene GFP inteiro, incluindo os codões start e stop (mas nada fora do gene).
- Precisamos de dois primers para o PCR, um primer forward e um primer reverse.
O primer forward liga-se à cadeia Crick e o primer reverse liga-se à cadeia Watson.
Queremos uma Tm 49-51C. Um programa denominado “Oligonucleotide properties calulator” pode calcular o Tm.
http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html
Também podem utilizar a seguinte fórmula: Tm = 4×(G+C)+2×(A+T)
Para o primer reverse, usar este site para obter o complemento reverso de uma sequência de DNA: Reverse Complement of Sequence.
A sequência dos primers deve ser descrita no relatório final.
Mais informação sobre desenho de primers.