Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria: diferenças entre revisões
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[[Imagem:AgaroseGel.jpg|thumb|centre|250px|Gel de agarose preparado para análise de DNA. O primeiro poço contém um padrão de DNA para determinação de pesos moleculares; os quatro poços seguintes mostram fragmentos de DNA com variados tamanhos, que estão presentes em algumas mas não em todas as amostras.]] |
[[Imagem:AgaroseGel.jpg|thumb|centre|250px|Gel de agarose preparado para análise de DNA. O primeiro poço contém um padrão de DNA para determinação de pesos moleculares; os quatro poços seguintes mostram fragmentos de DNA com variados tamanhos, que estão presentes em algumas mas não em todas as amostras.]] |
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== Actividades propostas == |
== Actividades propostas == |
Revisão das 17h50min de 27 de fevereiro de 2008
acima: ÍNDICE
Preparação das soluções para PCR
- Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos eppendorf marcados (1 e 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mL de Taq e 900 mL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800 μL);
- Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos eppendorf marcados (3, 4 e 5) a partir de 500 μL da diluição de 1000X e 500 μL de tampão de diluição 1X;
- Colocar 20 μL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10X; 50X; 100X; 200X; 400X (5 tubos);
- Adicionar 20 μL de PCR MasterMix a cada tubo de PCR;
- Colocar os tubos em gelo;
- Depois de agitadas no vortex, as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na
tabela abaixo.
Condições do PCR
Temperatura | Duração | Fase |
94 ºC | 120 seg | Desnaturação inicial |
94 ºC | 20 seg | Desnaturação |
40 ºC | 20 seg | Emparelhamento |
72 ºC | Taq = 20 seg e Pfu= 1 min 45 seg | Elongamento |
72 ºC | 120 seg | Elongamento final |
Esta sequência é repetida 30 vezes.
Análise Electroforética dos produtos de PCR
- Misturar 5 μL de produto de PCR com 5 μL de tampão de aplicação;
- Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%;
- O instrutor efectua a electroforese com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência;
- Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts;
- Fotografar o gel.
Actividades propostas
- Comparar o rendimento do PCR obtido com o da Taq polimerase comercial.
- Calcular o número de unidades na preparação.