Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria

acima: ÍNDICE

anterior: Preparação das Taq e Pfu DNA Polimerases de Escherichia coli recombinante | próximo: Desenho dos primers

Preparação das soluções para PCR

• Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos eppendorf marcados (1 e 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mL de Taq e 900 mL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800 μL);

• Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos eppendorf marcados (3, 4 e 5) a partir de 500 μL da diluição de 1000X e 500 μL de tampão de diluição 1X;

• Colocar 20 μL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10X; 50X; 100X; 200X; 400X (5 tubos);

• Adicionar 20 μL de PCR MasterMix a cada tubo de PCR;

• Colocar os tubos em gelo;

• Depois de agitadas no vortex, as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na

tabela abaixo.

Condições do PCR

Temperatura	Duração	Fase
94 ºC	120 seg	Desnaturação inicial
94 ºC	20 seg	Desnaturação
40 ºC	20 seg	Emparelhamento
72 ºC	Taq = 20 seg e Pfu= 1 min 45 seg	Elongamento
72 ºC	120 seg	Elongamento final

Esta sequência é repetida 30 vezes.

• Misturar 5 μL de produto de PCR com 5 μL de tampão de aplicação;

• Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%;

• O instrutor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência;

• Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts;

• Fotografar o gel;

• Comparar o rendimento do PCR com o rendimento obtido com a Taq polimerase comercial;

• Calcular o número de unidades na preparação.