Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante: diferenças entre revisões
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[[Engenharia Genética:Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria|Amplificação por PCR do gene GFP de ''Aequorea victoria'']] |
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[[Imagem:E coli.jpg|thumb|right|400px|Micrografia electrónica de bactérias ''Escherichia coli''.]] |
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[[Imagem:Plasmid_replication_(english).svg|thumb|right|400px|Comparação da actividade de plasmídeos não-integrativos (acima da linha) com epissomas (abaixo da linha), durante a divisão celular. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico e plasmídeos dividindo-de em duas bactérias idênticas, cada uma com o seu DNA cromossómico e plasmídeos. Na primeira situação, está representada uma bactéria com o seu DNA cromossómico, mas com um epissoma. A seguir, observa-se a mesma bactéria após integração do epissoma no DNA cromossómico. Esta bactéria divide-se em duas bactérias idênticas, cada uma com o epissoma integrado no seu genoma.]] |
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* Inocular 200 mL de ''SuperBroth'' com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37ºC, com agitação; |
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* Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação. |
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# Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação. |
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* Eliminar o sobrenadante e ressuspender o [http://en.wikipedia.org/wiki/Pellet ''pellet''] em 5 mL de tampão A; |
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* Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC); |
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* Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg [http://pt.wikipedia.org/wiki/Lisozima lisozima] (concentração final = 4 mg/mL); |
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* Adicionar 2 mL de tampão B com [http://en.wikipedia.org/wiki/PMSF PMSF] (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão); |
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# Adicionar 2 mL de tampão B com [http://en.wikipedia.org/wiki/PMSF PMSF] (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão); |
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* Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos ''eppendorf''; |
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* Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4ºC); |
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* Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL; |
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# Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL; |
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== Soluções == |
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* '''''Superbroth''''': (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro. |
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* '''Tampão ''Storage''''': 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol. |
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'''Tampão Storage''': 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol |
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Revisão das 16h19min de 26 de fevereiro de 2008
acima: ÍNDICE
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Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria
Dia 1
- Inocular 4 mL de meio LB amp com Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
- Incubar a 37 ºC, com agitação.
Dia 2
- Inocular 200 mL de SuperBroth com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37ºC, com agitação;
- Quando a Densidade Óptica (λ=600nm) ≈0.4, adicionar 0.4 mL IPTG 1M (concentração final = 2 mM);
- Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação.
Dia 3
- Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
- Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de tampão A;
- Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC);
- Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg lisozima (concentração final = 4 mg/mL);
- Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
- Adicionar 2 mL de tampão B com PMSF (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
- No gelo, guardar ≈0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 1;
- Incubar a 75 ºC, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
- Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
- Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos eppendorf;
- Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4ºC);
- Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
- No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 2;
- Misturar com igual volume (≈4 mL) tampão Storage com 50 % de glicerol;
- Misturar com igual volume (≈8 mL) tampão Storage com 75 % de glicerol;
- O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;
- Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC (para usar na próxima etapa).
Soluções
- Superbroth: (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro.
- Tampão A: 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM dextrose + 1 mM EDTA.
- Tampão B: 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM KCl + 1 mM EDTA + 0.5% Tween 20 (1%) + 1 mM PMSF.
- Tampão Storage: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol.