Engenharia genética/Preparação das Taq e Pfu DNA polimerases de Escherichia coli recombinante: diferenças entre revisões

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[[Imagem:E coli at 10000x.jpg|thumb|left|500px|Micrografia electrónica a baixa temperatura de um agregado de bactérias ''E. coli'' (amplificação: 10000X).]]
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[[Imagem:Plasmid_replication_(english).svg‎|thumb|right|500px]]


[[Imagem:E coli.jpg|thumb|right|500px]]]




=== Dia 1 ===
=== Dia 1 ===

# Inocular 4 mL de meio LB amp com ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
# Inocular 4 mL de [http://en.wikipedia.org/wiki/LB_medium meio LB] amp com ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
# Incubar a 37 ºC, com agitação.

# [http://en.wikipedia.org/wiki/Incubator_%28microbiology%29 Incubar] a 37 ºC, com agitação.






=== Dia 2 ===
=== Dia 2 ===

# Inocular 200 mL de ''SuperBroth'' com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37ºC, com agitação;
# Inocular 200 mL de ''SuperBroth'' com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37ºC, com agitação;

# Quando a DO (600nm) ~ 0.4, adicionar 0.4 mL IPTG 1M (concentração final = 2 mM);
# Quando a [http://en.wikipedia.org/wiki/Optical_density Densidade Óptica] (λ=600nm) ≈0.4, adicionar 0.4 mL [http://en.wikipedia.org/wiki/IPTG IPTG] 1M (concentração final = 2 mM);

# Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação.
# Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação.


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=== Dia 3 ===
=== Dia 3 ===

# Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
# Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;

# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
# [http://en.wikipedia.org/wiki/Laboratory_centrifuge Centrifugar] (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
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# Eliminar o sobrenadante e ressuspender o ''pellet'' em 5 mL de tampão A;

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# Eliminar o sobrenadante e ressuspender o [http://en.wikipedia.org/wiki/Pellet ''pellet''] em 5 mL de tampão A;

# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC);
# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC);

# Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg lisozima (concentração final = 4 mg/mL);
# Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg [http://pt.wikipedia.org/wiki/Lisozima lisozima] (concentração final = 4 mg/mL);

# Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
# Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;

# Adicionar 2 mL de tampão B com PMSF (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
# Adicionar 2 mL de tampão B com [http://en.wikipedia.org/wiki/PMSF PMSF] (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
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# No gelo, guardar ~0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 1''';

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# No gelo, guardar ≈0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 1''';

# Incubar a 75 ºC, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
# Incubar a 75 ºC, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;

# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
# Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);

# Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos ''eppendorf'';
# Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos ''eppendorf'';

# Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4ºC);
# Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4ºC);

# Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
# Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;

# No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 2''';
# No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo ''eppendorf'', previamente marcado como '''Amostra 2''';
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# Misturar com igual volume (~ 4 mL) tampão ''Storage'' com 50 % de glicerol;
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# Misturar com igual volume (~ 8 mL) tampão ''Storage'' com 75 % de glicerol;
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# O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ~ 8 mL de solução;
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# Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC para serem usados na próxima aula prática.


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# Misturar com igual volume (≈4 mL) tampão ''Storage'' com 50 % de glicerol;

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# Misturar com igual volume (≈8 mL) tampão ''Storage'' com 75 % de glicerol;

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# O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;

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# Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC (para usar na próxima etapa).




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[[Imagem:Plasmid_replication_(english).svg]]


'''''Superbroth''''': (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro
'''''Superbroth''''': (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro

Revisão das 15h42min de 26 de fevereiro de 2008

acima: ÍNDICE


Micrografia electrónica a baixa temperatura de um agregado de bactérias E. coli (amplificação: 10000X).


Ficheiro:E coli.jpg

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Dia 1

  1. Inocular 4 mL de meio LB amp com Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq;
  1. Incubar a 37 ºC, com agitação.


Dia 2

  1. Inocular 200 mL de SuperBroth com 0.4 mL da cultura anterior e incubar a 37ºC, com agitação;
  1. Quando a Densidade Óptica (λ=600nm) ≈0.4, adicionar 0.4 mL IPTG 1M (concentração final = 2 mM);
  1. Deixar crescer durante 16 a 20 horas, com incubação a 37ºC, com agitação.


Dia 3

  1. Dividir a cultura em duas partes de 25 mL e distribuir em tubos Falcon de 50 mL;
  1. Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
  1. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 5 mL de tampão A;
  1. Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4ºC);
  1. Ressuspender as células em 2 mL de tampão A + 20 mg lisozima (concentração final = 4 mg/mL);
  1. Incubar à temperatura ambiente, durante 15 minutos;
  1. Adicionar 2 mL de tampão B com PMSF (adicionar PMSF imediatamente antes da utilização do tampão);
  1. No gelo, guardar ≈0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 1;
  1. Incubar a 75 ºC, durante 60 minutos, num banho de água com agitação;
  1. Centrifugar (5000 rpm, 10 minutos, 4 ºC);
  1. Transferir o máximo possível de sobrenadante para alguns tubos eppendorf;
  1. Centrifugar (15300 rpm, 20 minutos, 4ºC);
  1. Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 15 mL;
  1. No gelo, guardar 0.1 mL da solução num tubo eppendorf, previamente marcado como Amostra 2;
  1. Misturar com igual volume (≈4 mL) tampão Storage com 50 % de glicerol;
  1. Misturar com igual volume (≈8 mL) tampão Storage com 75 % de glicerol;
  1. O lisado está agora diluído 4 vezes e, cada grupo de trabalho, deverá ter ≈8 mL de solução;
  1. Marcar o tubo que contém o lisado e guardar a -20 ºC (para usar na próxima etapa).



Superbroth: (32 g triptona + 20 g extracto de levedura + 5 g NaCl + 1,25 mL 4N NaOH) / litro 

Tampão A: 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM dextrose + 1 mM EDTA

Tampão B: 10 mM Tris-HCl (pH 7.9) + 50 mM KCl + 1 mM EDTA + 0.5% Tween 20 (1%) + 1 mM PMSF 

Tampão Storage: 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 100 mM NaCl + 0.1 mM EDTA + 0.5 mM DTT + 1% Triton X-100 + 50% / 75% glicerol
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