Engenharia genética/Clonagem por PCR: diferenças entre revisões
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Revisão das 14h43min de 26 de fevereiro de 2008
PCR é uma técnica muito usada para clonar enzimaticamente fragmentos de DNA, sem usar microrganismos vivos.
Esta técnica permite um aumento exponencial da quantidade de DNA em amplificação.
O processo desenvolvido no PCR é cíclico e ocorre segundo três etapas sucessivas que, normalmente, se repetem por 30 ou 40 ciclos.
- A iniciação do processo consiste em aquecer à temperatura de 94-96 ºC (ou 98 ºC para polimerases extremamente termoestáveis), durante alguns minutos.
Esta etapa é essencial para as DNA polimerases que necessitam de activação por calor.
- O primeiro passo do ciclo consiste na desnaturação à temperatura de 94-98 ºC, por 20-30 segundos.
Nesta etapa, ocorre dissociação das duplas cadeias de DNA template (molde) e primers, através da destruição das pontes de Hidrogénio estabelecidas entre bases complementares. Obtêm-se somente cadeias simples de DNA.
- De seguida ocorre o emparelhamento a 50-65 ºC, por 20-40 segundos.
Os primers estão sujeitos ao movimento Browniano.
As ligações mais estáveis — pontes de Hidrogénio DNA-DNA — formam-se entre os primers e o template que emparelham exactamente e, nessa pequena porção de DNA de dupla cadeia, a polimerase liga-se e copia um pouco do template.
Quando existe uma porção emparelhada e ligeiramente polimerisada, a ligação é tão forte, que dificilmente é quebrada.
- Finalmente ocorre a polimerização / elongação a 72ºC (temperatura usada com Taq polimerase).
A polimerase adiciona dNTP´s de 5'-3', sintetizando uma nova cadeia de DNA complementar à cadeia de DNA molde.
O tempo desta etapa depende da DNA polimerase usada e no comprimento do fragmento de DNA a amplificar.
Como ambas as cadeias de DNA são copiadas durante o PCR, há um aumento exponencial do número de cópias do gene.
Supondo que existe apenas uma cópia do gene desejado antes do ciclo começar, após 1 ciclo, haverá 2 cópias, depois de 2 ciclos, haverá 4 cópias, três ciclos resultarão em 8 cópias e assim progressivamente.
Para análise posterior dos produtos de PCR, pode proceder-se a uma electroforese.