Engenharia genética/Os vetores do sistema pET: diferenças entre revisões

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Revisão das 12h07min de 26 de fevereiro de 2008

acima: ÍNDICE

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Considerações iniciais

Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET.

O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes.

Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.

Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência de uma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão.

O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon e ompT.

Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais se salientam a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.

Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.

Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET

Estirpe	Derivação	Características Especiais	Resistência a Antibióticos	Competência das Células
BL21(DE3)	B834	Faltam as proteases lon e ompT	Nenhuma	Sim

Vantagens do Sistema pET:

Poderoso:

Níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal;
Adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.

Versátil:

Escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização;
Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames;
Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.

Rápido:

Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados;
Locais de restrição convenientes para subclonagem de outros vectores;
Escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.

Completo:

Variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.

Ligações Externas

pET System Tutorial in Novagen 2002–2003 Catalog

Newsletter

pET Manual

http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/pettablemenued.html pET E. coli T7 expression vectors]

@@ Linha 25: / Linha 25: @@
-====Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET====
+=== Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET ===
 <center>
@@ Linha 37: / Linha 37: @@
 == Vantagens do Sistema pET: ==
-* '''Poderoso''': níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal; adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
-* '''Versátil''': escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização; Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames; Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
-* '''Rápido''': Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados; restriction sites convenientes para subclonagem de outros vectores; escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.
-* '''Completo''': variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.
+# '''Poderoso''':
+*Níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal;
+*Adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
+# '''Versátil''':
-===Ligações Externas===
+*Escolha das ''tags'' de fusão em [http://en.wikipedia.org/wiki/N-terminal N-terminal] e [http://en.wikipedia.org/wiki/C-terminus C-terminal] para detecção, purificação e localização;
+*Existência de [http://en.wikipedia.org/wiki/Multiple_cloning_site multiple cloning sites] expandidas nas três [http://en.wikipedia.org/wiki/Reading_frame reading frames];
+*[http://en.wikipedia.org/wiki/Origin_of_replication Origem de replicação] f1 para [http://en.wikipedia.org/wiki/Mutagenesis mutagénese] e sequenciação.
+# '''Rápido''':
+*Sistemas baseados em ''E.coli'' para rápida obtenção de resultados;
+*[http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_site Locais de restrição] convenientes para [http://en.wikipedia.org/wiki/Subcloning subclonagem] de outros vectores;
+*Escolha de métodos de [http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_purification purificação das proteínas] num passo único sem [http://en.wikipedia.org/wiki/Antibody anticorpos].
+# '''Completo''':
+*Variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.
+== Ligações Externas ==
 [http://biotech.arl.arizona.edu/education/MCB473/mcb473docs/pET_System.pdf '''pET System Tutorial''' in Novagen 2002–2003 Catalog]