Engenharia genética/Os vetores do sistema pET: diferenças entre revisões
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Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET. |
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O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes |
O sistema pET da [http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/home.html Novagen] tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de [http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_recombinant_proteins proteínas recombinantes]. |
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[[Imagem:T7 RNA polymerase at work.png|thumb|right|470px|Representação esquemática da T7 RNA Polimerase (azul) produzindo mRNA (verde) a partir de um ''template'' de DNA em dupla cadeia (laranja). Baseado em [http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1MSW PDB ID 1MSW]]] |
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Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo [http://en.wikipedia.org/wiki/Promotor promotor] T7 (do [http://en.wikipedia.org/wiki/T7_phage bacteriófago T7]) para dirigir a expressão de genes-alvo. |
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Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq. |
Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq. |
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===Ligações Externas=== |
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[http://biotech.arl.arizona.edu/education/MCB473/mcb473docs/pET_System.pdf '''pET System Tutorial''' in Novagen 2002–2003 Catalog] |
[http://biotech.arl.arizona.edu/education/MCB473/mcb473docs/pET_System.pdf '''pET System Tutorial''' in Novagen 2002–2003 Catalog] |
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[http://www.emdbiosciences.com/docs/NDIS/inno01-000.pdf |
[http://www.emdbiosciences.com/docs/NDIS/inno01-000.pdf Newsletter] |
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[http://www.merckbiosciences.co.uk/docs/docs/PROT/TB055.pdf pET Manual] |
[http://www.merckbiosciences.co.uk/docs/docs/PROT/TB055.pdf pET Manual] |
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http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/pettablemenued.html pET E. coli T7 expression vectors] |
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Revisão das 11h50min de 26 de fevereiro de 2008
Considerações iniciais
Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET.
O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes.
Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.
Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência de uma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão.
O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon e ompT.
Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais se salientam a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.
Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.
Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET
| Estirpe | Derivação | Características Especiais | Resistência a Antibióticos | Competência das Células |
| BL21(DE3) | B834 | Faltam as proteases lon e ompT | Nenhuma | Sim |
Vantagens do Sistema pET:
- Poderoso: níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal; adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
- Versátil: escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização; Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames; Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
- Rápido: Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados; restriction sites convenientes para subclonagem de outros vectores; escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.
- Completo: variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.
Ligações Externas
pET System Tutorial in Novagen 2002–2003 Catalog
http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/pettablemenued.html pET E. coli T7 expression vectors]