Engenharia genética/Os vetores do sistema pET: diferenças entre revisões
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Revisão das 15h49min de 25 de fevereiro de 2008
Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET.
O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.
Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência duma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão. O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon e ompT.
Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais salientamos a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.
Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.
Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET
Estirpe | Derivação | Características Especiais | Resistência a Antibióticos | Competência das Células |
BL21(DE3) | B834 | Faltam as proteases lon e ompT | Nenhuma | Sim |
Vantagens do Sistema pET:
- Poderoso: níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal; adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
- Versátil: escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização; Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames; Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
- Rápido: Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados; restriction sites convenientes para subclonagem de outros vectores; escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.
- Completo: variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.