Engenharia genética/Os vetores do sistema pET: diferenças entre revisões

Origem: Wikilivros, livros abertos por um mundo aberto.
[edição não verificada][edição não verificada]
Conteúdo apagado Conteúdo adicionado
MPCF (discussão | contribs)
Sem resumo de edição
MPCF (discussão | contribs)
Sem resumo de edição
Linha 1: Linha 1:
{{Navegação| [[Engenharia Genética:ÍNDICE|'''ÍNDICE''']]
{{Na''Texto em itálico''vegação| [[Engenharia Genética:ÍNDICE|'''ÍNDICE''']]
|[[Engenharia Genética:As DNA Polimerases Taq e Pfu|As DNA Polimerases Taq e Pfu]]|
|[[Engenharia Genética:As DNA Polimerases Taq e Pfu|As DNA Polimerases Taq e Pfu]]|
[[Engenharia Genética:Clonagem por PCR|Clonagem por PCR]]
[[Engenharia Genética:Clonagem por PCR|Clonagem por PCR]]
}}
}}


Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET.


O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.


Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET. O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo. Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência duma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão.
Considerando que a RNA polimerase da ''E. coli'' não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência duma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão.
O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon and ompT. Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais salientamos a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.
O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases ''lon'' e ''ompT''.
Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais salientamos a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.
Utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.


Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.
Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.



Derivação
=====Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET=====
Características Especiais

Resistência a Antibióticos
<center>
Competência das Células
{| border Estirpe
BL21(DE3)
| Estirpe|| Derivação|| Características Especiais|| Resistência a Antibióticos|| Competência das Células
B834
|-
Faltam as proteases lon e ompT
| BL21(DE3)|| B834|| Faltam as proteases ''lon'' e ''ompT''|| Nenhuma|| Sim
Nenhuma
|}
Sim
</center>




== '''Vantagens do Sistema pET:''' ==
===Vantagens do Sistema pET: ===
* '''Poderoso''': níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal; adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
* '''Poderoso''': níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal; adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
* '''Versátil''': escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização; Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames; Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
* '''Versátil''': escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização; Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames; Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.

Revisão das 14h58min de 22 de fevereiro de 2008

Predefinição:Na''Texto em itálico''vegação

Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET.

O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes. Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.

Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência duma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão. O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon e ompT.

Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais salientamos a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.

Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.


Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET
Estirpe Derivação Características Especiais Resistência a Antibióticos Competência das Células
BL21(DE3) B834 Faltam as proteases lon e ompT Nenhuma Sim


Vantagens do Sistema pET:

  • Poderoso: níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal; adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
  • Versátil: escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização; Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames; Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
  • Rápido: Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados; restriction sites convenientes para subclonagem de outros vectores; escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.
  • Completo: variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.


pET System Tutorial in Novagen 2002–2003 Catalog