Engenharia genética/Amplificação por PCR do gene GFP de Aequorea victoria

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1. Fazer uma diluição de 50X, em 2 tubos eppendorf marcados (1 e 2), fazendo 2 diluições sucessivas de 10X a partir de 100 mL de Taq e 900 mL do tampão de diluição 1X e depois 5X (200 μL → 800μL);
2. Fazer 3 diluições sucessivas de 2X em 3 tubos eppendorf marcados (3, 4 e 5) a partir de 500 mL da diluição de 1000X e 500 mL de tampão de diluição 1X;
3. Colocar 20 mL das diluições em diferentes tubos de PCR: 10X; 50X; 100X; 200X; 400X (5 tubos);
4. Adicionar 20 mL de PCR MasterMix a cada tubo de PCR;
5. Colocar os tubos em gelo;
6. Depois de agitadas no vortex, as misturas são sujeitas a PCR de acordo com as condições especificadas na tabela abaixo;
7. Durante o tempo de espera, desenhar no computador os primers necessários para amplificar o gene GFP;
8. Misturar 5 mL de produto de PCR com 5 mL de tampão de aplicação;
9. Aplicar as amostras num gel de agarose 0,8%;
10. O instrutor irá fazer um gel com as amostras correspondentes aos produtos de PCR de referência;
11. Correr o gel, durante 20 minutos, a 220 volts;
12. Fotografar o gel;
13. Comparar o rendimento do PCR com o rendimento obtido com a Taq polimerase comercial;
14. Calcular o número de unidades na preparação.

Condições do PCR

Temperatura	Duração	Fase
94 ºC	120 seg	Desnaturação inicial
94 ºC	20 seg	Desnaturação
40 ºC	20 seg	Emparelhamento
72 ºC	Taq = 20 seg e Pfu= 1 min 45 seg	Elongamento
72 ºC	120 seg	Elongamento final

Esta sequência é repetida 30 vezes.