Bioquímica/Cinética enzimática: diferenças entre revisões

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= Cinética enzimática =
O estudo da função de enzimas envolve uma aproximação multidisciplinar. Por um lado, a determinação da estrutura, usando técnicas espectroscópicas como a difracçãodifração de raios-X em proteínas cristalizadas ou a ressonância magnética nuclear (RMN) em proteínas em solução, permite localizar a posição dos diferentes resíduos no espaço. Este tipo de estudo revela muitas vezes detalhes sobre o mecanismo da reacçãoreação, ou seja, a forma e sequência de ligações do substrato ao centro activoativo para ser catalisado. Por outro lado, é importante conhecer parâmetros cinéticos, como a velocidade da reacçãoreação catalisada, o efeito de inibidores nessa velocidade, quantas moléculas a enzima consegue catalisar por segundo, etc, para poder ser aferida a eficiência dessa enzima e a forma como é regulada.
 
Esta última aproximação ao estudo de enzimas, a '''cinética enzimática''', é um dos campos de estudo mais clássicos da Bioquímica. Nenhum estudo sobre uma enzima se encontra completo sem estudos cinéticos.
 
== Progressão da reacçãoreação ==
Para que uma reacçãoreação enzimática se dê, a enzima (E) e o substrato (S) têm de se encontrar e formar o '''complexo enzima-substrato''' (ES). Como referido anteriormente, embora este possa parecer um formalismo, a formação deste complexo é uma peça chave na compreensão da progressão de uma catálise. O complexo ES é lábil: a enzima pode dissociar-se do seu substrato sem ter havido reacçãoreação. Este equilíbrio é expresso sob a forma:
 
:: E+S <math>\leftrightarrows</math> ES <!-- (k1 k-1em índice) -->
:: E+S<math>\leftrightarrows</math>[ES]<math>\rightarrow</math>E+P <!-- (k2 k-2 k3) -->
 
A reacçãoreação de formação de ES é normalmente mais rápida que a reacçãoreação de dissociação de EP, ou seja, a libertação do produto da reacçãoreação é normalmente um '''passo limitante''' da reacçãoreação.
 
== Velocidade inicial ==
O estudo de uma reacçãoreação enzimática ''in vitro'' não reflectereflete a verdadeira situação das enzimas em células, mas possibilita a simplificação da determinação de parâmetros cinéticos. Dentro de uma célula, o substrato pode estar confinado a um dado compartimento e não sofrer facilmente difusão: por exemplo, pode ser o produto de uma reacçãoreação anterior numa via metabólica, pelo que passa directamentediretamente de uma enzima para a outra. Normalmente, os estudos ''in vitro'' usam uma concentração de substrato muito superior à concentração de enzima, para que a probabilidade de uma enzima encontrar uma molécula de substrato seja o mais elevada possível.
[[Imagem:Michaelis-Menten.png|thumb|300px|Representação da variação da velocidade inicial da reacçãoreação (V) em função da concentração de substrato ([S]).]]
Outra vantagem do uso de uma concentração de substrato ([S]) maior que a concentração de enzima ([E]) é a possibilidade de monitorizar a variação da velocidade de reacçãoreação com [E] sem que haja uma variação apreciável de [S]. Como S está a ser convertido em P, [S] decresce com o tempo, à medida que o produto se acumula em solução. Como a [S] influencia a formação do complexo ES (e portanto da formação de produto), vai influenciar também a velocidade da reacçãoreação. No entanto, se for feita apenas a monitorização da velocidade inicial da reacçãoreação (tipicamente, durante os primeiros 30 a 60 segundos), a variação de [S] não é significativa e pode ser tomada como constante.
 
Nestas condições, a velocidade medida ('''velocidade inicial''', V<sub>0</sub>) depende apenas de [E]. Um gráfico de V<sub>0</sub> em função de [S] apresenta uma forma característica de semi-hipérbole: a baixas concentrações de substrato, a variação de V<sub>0</sub> com [S] é linear; à medida que se usam [S] mais elevadas, V<sub>0</sub> sofre uma variação cada vez menor, tendendo para um valor limite. Este valor é denominado '''velocidade máxima''', V<sub>max</sub>.
 
A que se deve este comportamento? A baixas concentrações de substrato, a maior parte da enzima em solução encontra-se na forma livre, E; usando concentrações suficientemente elevadas de S, toda a enzima se encontrará, num dado instante, em complexo com molécula(s) de substrato, isto é, na forma ES. Por maior que seja a concentração de substrato utilizada, as moléculas de enzima não têm capacidade de catalisar o substrato, por todos os centros activosativos se encontrarem ocupados. Nestas condições, diz-se que a enzima se encontra '''saturada'''.
 
== Equação de Michaelis-Menten ==
É assumida, nesta dedução, a existência de um '''estado estacionário''', em que [ES] permanece constante ao longo do tempo. A teoria do estado estacionário, introduzida por G. E. Briggs e [[w:J. B. S. Haldane|J. B. S. Haldane]] em 1925, considera que a velocidade a que o complexo ES se forma é aproximadamente igual à velocidade da sua dissociação. Existe um curto período de tempo, normalmente na ordem dos microssegundos, em que há uma acumulação de ES – '''estado pré-estacionário'''. O estudo da cinética enzimática envolvendo a teoria do estado estacionário é referida como '''cinética do estado estacionário'''.
 
Também é assumido que a concentração de produto é negligível no início da reacçãoreação, logo é negligível a extensão da reacçãoreação inversa no equilíbrio entre substrato e produto, S <math>\leftrightarrows</math> P, considerando-se apenas a reacçãoreação directadireta na dedução da equação. Assim, a reacçãoreação é descrita por
 
:: E+S <math>\leftrightarrows</math> <!-- (k1 k-1) --> [ES] <math>\rightarrow</math> <!-- (k2) --> E+P
 
Como já referido, a formação de [ES] limita a velocidade da reacçãoreação, medida como V<sub>0</sub>:
 
:: V<sub>0</sub>=k<sub>2</sub>[ES]
 
Se [ES] fosse facilmente mensurável, o valor de k<sub>2</sub> seria simples de determinar directamentediretamente. No entanto, esse não é o caso, e o valor de [ES] tem de ser deduzido. Para tal, considere-se que a concentração do total de enzima presente na reacçãoreação, [E]<sub>t</sub>, é o somatório da concentração de enzima em complexo com o substrato, [ES], e da concentração de enzima "livre" (não ligada a substrato), [E]<sub>l</sub>:
 
:: [E]<sub>t</sub> = [E]<sub>l</sub> + [ES]
 
== Tratamento matemático e gráfico da equação de Michaelis-Menten ==
Embora o gráfico obtido directamentediretamente da equação de Michaelis-Menten seja de interpretação relativamente simples, existem tratamentos matemáticos que simplificam a representação gráfica da equação e permitem a obtenção rápida de parâmetros cinéticos.
 
O tratamento mais conhecido e porventura mais utilizado é o de '''Lineweaver-Burk'''. A equação de Michaelis-Menten pode ser transformada numa equação da rectareta, do tipo y=ax+b:
 
:: <math>V_o=\frac{V_max [S]} {K_M + [S]}\Leftrightarrow \frac{1}{V_o}=\frac{K_M + [S]}{V_max [S]} \Leftrightarrow \frac{1}{V_o}= \frac{K_M}{V_max [S]} + \frac{[S]}{V_max [S]} \Leftrightarrow \frac{1}{V_o}=\frac{K_M}{V_max [S]} + \frac{1}{V_max}</math>
 
[[Imagem:Lineweaver-Burke plot.PNG|thumb|250px|Gráfico de Lineweaver-Burk.]]
Esta última forma da equação de Michaelis-Menten é conhecida como '''equação de Lineweaver-Burk'''. Um gráfico de <math>\frac{1}{V_o}</math> (y) em função de <math>\frac{1}{[S]}</math> (x) é uma rectareta de declive igual a <math>\frac{K_M}{V_max}</math> (a), que intercepta o eixo das coordenadas na origem no ponto <math>\frac{1}{V_max}</math> (b), interceptando também o eixo das abcissas no ponto <math>\frac{-1}{K_M}.</math> Este gráfico é também chamado '''duplo recíproco''' pois trata-se de uma representação gráfica do recíproco de ambos os parâmetros V<sub>o</sub> e [S].
 
Este tipo de tratamento matemático permite uma determinação mais precisa de V<sub>max</sub>, um parâmetro que só se obtém por aproximação num gráfico de Michaelis-Menten.
 
Outra vantagem na utilização da equação de Lineweaver-Burk é visível em estudos de inibição enzimática, sendo relativamente simples de detectar e distinguir entre diferentes tipos de inibição: ao usar diferentes concentrações de inibidores, e consoante o tipo de inibição efectuadaefetuada, o gráfico de Lineweaver-Burk muda de uma forma bem estudada, como será mais claro no capítulo sobre inibição enzimática.
 
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