Engenharia genética/Os vetores do sistema pET: diferenças entre revisões
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== Considerações iniciais == |
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Considerando que a RNA polimerase da ''E. coli'' não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre [http://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_%28genetics%29 transcrição] do gene-alvo na ausência de uma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de [http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_expression expressão]. |
Considerando que a RNA polimerase da ''E. coli'' não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre [http://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_%28genetics%29 transcrição] do gene-alvo na ausência de uma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de [http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_expression expressão]. |
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O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as [http://en.wikipedia.org/wiki/Protease proteases] ''lon'' e ''ompT''. |
O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as [http://en.wikipedia.org/wiki/Protease proteases] ''lon'' e ''ompT''. |
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Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq. |
Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos ''Escherichia coli'' BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq. |
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=== Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET === |
=== Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET === |
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== Ligações Externas == |
== Ligações Externas == |
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* [http://www.merckbiosciences.co.uk/docs/docs/PROT/TB055.pdf Novagen • '''pET System Manual''' • 11th Edition] |
* [http://www.merckbiosciences.co.uk/docs/docs/PROT/TB055.pdf Novagen • '''pET System Manual''' • 11th Edition] |
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* [http://biotech.arl.arizona.edu/education/MCB473/mcb473docs/pET_System.pdf '''pET System Tutorial''' in Novagen 2002–2003 Catalog] |
* [http://biotech.arl.arizona.edu/education/MCB473/mcb473docs/pET_System.pdf '''pET System Tutorial''' in Novagen 2002–2003 Catalog] |
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* [http://www.emdbiosciences.com/docs/NDIS/inno01-000.pdf NEWSLETTER OF NOVAGEN, INC. • ADVANCED PRODUCTS AND PROTOCOLS FOR MOLECULAR BIOLOGY RESEARCH — VOLUME 1 • NUMBER 1 — MAY 1994 — '''The pET System: Your Choice for Expression'''] |
* [http://www.emdbiosciences.com/docs/NDIS/inno01-000.pdf NEWSLETTER OF NOVAGEN, INC. • ADVANCED PRODUCTS AND PROTOCOLS FOR MOLECULAR BIOLOGY RESEARCH — VOLUME 1 • NUMBER 1 — MAY 1994 — '''The pET System: Your Choice for Expression'''] |
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* [http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/pettablemenued.html '''pET E. coli T7 expression vectors'''] |
* [http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/pettablemenued.html '''pET E. coli T7 expression vectors'''] |
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Revisão das 16h39min de 24 de agosto de 2010
Considerações iniciais
Para amplificar as DNA polimerases Taq e Pfu, utilizaram-se os vectores pET.
O sistema pET da Novagen tem sido reconhecido como uma das mais poderosas abordagens disponíveis para produção de proteínas recombinantes.
Existe uma vasta variedade de vectores pET, todos derivados do pBR322 e com base num sistema comandado pelo promotor T7 (do bacteriófago T7) para dirigir a expressão de genes-alvo.
Considerando que a RNA polimerase da E. coli não reconhece o promotor T7, supõe-se que não ocorre transcrição do gene-alvo na ausência de uma fonte de T7 RNA polimerase e o passo de clonagem está, deste modo, efectivamente desacoplado do passo de expressão.
O hospedeiro mais comummente utilizado é o BL21, o qual tem a vantagem de ser deficiente em ambas as proteases lon e ompT.
Recentemente, a Novagen introduziu dois derivados do BL21 para finalidades especiais, dos quais se salientam a série B834 que é um auxotrófico deficiente em metionina e, então, permite elevada actividade específica marcando as proteínas-alvo com 35S-metionina ou selenometionina.
Como estirpe hospedeira do Sistema pET utilizámos Escherichia coli BL21(DE3) pET-Pfu e pET-Taq.
Descrição da Estirpe Hospedeira do Sistema pET
| Estirpe | Derivação | Características Especiais | Resistência a Antibióticos | Competência das Células |
| BL21(DE3) | B834 | Faltam as proteases lon e ompT | Cloranfenicol | Sim |
Vantagens do Sistema pET:
Poderoso:
- Níveis de expressão mais elevados, maior controlo sobre a expressão basal;
- Adequação da escolha de vectores e estirpes hospedeiras ao controlo dos níveis de expressão basal e induzido.
Versátil:
- Escolha das tags de fusão em N-terminal e C-terminal para detecção, purificação e localização;
- Existência de multiple cloning sites expandidas nas três reading frames;
- Origem de replicação f1 para mutagénese e sequenciação.
Rápido:
- Sistemas baseados em E.coli para rápida obtenção de resultados;
- Locais de restrição convenientes para subclonagem de outros vectores;
- Escolha de métodos de purificação das proteínas num passo único sem anticorpos.
Completo:
- Variedade nas configurações do sistema e muitos produtos de apoio.