Bioquímica/Cinética enzimática: diferenças entre revisões

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= Cinética enzimática =
O estudo da função de enzimas envolve uma aproximação multidisciplinar. Por um lado, a determinação da estrutura, usando técnicas espectroscópicas como a difracção de raios-X em proteínas cristalizadas ou a ressonância magnética nuclear (RMN) em proteínas em solução, permite localizar a posição dos diferentes resíduos no espaço. Este tipo de estudo revela muitas vezes detalhes sobre o mecanismo da reacção, ou seja, a forma e sequência de ligações do substrato ao centro activo para ser catalisado. Por outro lado, é importante conhecer parâmetros cinéticos, como a velocidade da reacção catalisada, o efeito de inibidores nessa velocidade, quantas moléculas a enzima consegue catalisar por segundo, etc, para poder ser aferida a eficiência dessa enzima e a forma como é regulada.
 
Esta última aproximação ao estudo de enzimas, a '''cinética enzimática''', é um dos campos de estudo mais clássicos da Bioquímica. Nenhum estudo sobre uma enzima se encontra completo sem estudos cinéticos.
 
== Progressão da reacção ==
 
Para que uma reacção enzimática se dê, a enzima (E) e o substrato (S) têm de se encontrar e formar o '''complexo enzima-substrato''' (ES). Como referido anteriormente, embora este possa parecer um formalismo, a formação deste complexo é uma peça chave na compreensão da progressão de uma catálise. O complexo ES é lábil: a enzima pode dissociar-se do seu substrato sem ter havido reacção. Este equilíbrio é expresso sob a forma:
 
:: E+S <math>\leftrightarrows</math> ES <!-- (k1 k-1em índice) -->
 
A enzima pode então transformar o substrato num produto (P). Existe de forma transiente um complexo EP, havendo então dissociação deste complexo em enzima livre (E) e produto (P). Este mecanismo pode escrever-se na forma simplificada:
 
:: E+S<math>\leftrightarrows</math>[ES]<math>\rightarrow</math>E+P <!-- (k2 k-2 k3) -->
 
A reacção de formação de ES é normalmente mais rápida que a reacção de dissociação de EP, ou seja, a libertação do produto da reacção é normalmente um '''passo limitante''' da reacção.
 
== Velocidade inicial ==
 
O estudo de uma reacção enzimática ''in vitro'' não reflecte a verdadeira situação das enzimas em células, mas possibilita a simplificação da determinação de parâmetros cinéticos. Dentro de uma célula, o substrato pode estar confinado a um dado compartimento e não sofrer facilmente difusão: por exemplo, pode ser o produto de uma reacção anterior numa via metabólica, pelo que passa directamente de uma enzima para a outra. Normalmente, os estudos ''in vitro'' usam uma concentração de substrato muito superior à concentração de enzima, para que a probabilidade de uma enzima encontrar uma molécula de substrato seja o mais elevada possível.
[[ImageImagem:Michaelis-Menten.png|thumb|300px|Representação da variação da velocidade inicial da reacção (V) em função da concentração de substrato ([S]).]]
Outra vantagem do uso de uma concentração de substrato ([S]) maior que a concentração de enzima ([E]) é a possibilidade de monitorizar a variação da velocidade de reacção com [E] sem que haja uma variação apreciável de [S]. Como S está a ser convertido em P, [S] decresce com o tempo, à medida que o produto se acumula em solução. Como a [S] influencia a formação do complexo ES (e portanto da formação de produto), vai influenciar também a velocidade da reacção. No entanto, se for feita apenas a monitorização da velocidade inicial da reacção (tipicamente, durante os primeiros 30 a 60 segundos), a variação de [S] não é significativa e pode ser tomada como constante.
 
A que se deve este comportamento? A baixas concentrações de substrato, a maior parte da enzima em solução encontra-se na forma livre, E; usando concentrações suficientemente elevadas de S, toda a enzima se encontrará, num dado instante, em complexo com molécula(s) de substrato, isto é, na forma ES. Por maior que seja a concentração de substrato utilizada, as moléculas de enzima não têm capacidade de catalisar o substrato, por todos os centros activos se encontrarem ocupados. Nestas condições, diz-se que a enzima se encontra '''saturada'''.
 
== Equação de Michaelis-Menten ==
 
A semi-hipérbole correspondente ao comportamento da velocidade de uma enzima em função da concentração do substrato pode ser descrita matematicamente pela '''equação de Michaelis-Menten''':
 
:: <math>V_0=\frac{V_{max} [S]}{K_M + [S]}</math>
 
em que [S], V<sub>0</sub> e V<sub>max</sub> são as grandezas anteriormente definidas e K<sub>M</sub> a '''constante de Michaelis'''. Esta equação pode ser deduzida de forma intuitiva considerando a forma como se desenrola a catálise enzimática.
Também é assumido que a concentração de produto é negligível no início da reacção, logo é negligível a extensão da reacção inversa no equilíbrio entre substrato e produto, S <math>\leftrightarrows</math> P, considerando-se apenas a reacção directa na dedução da equação. Assim, a reacção é descrita por
 
:: E+S <math>\leftrightarrows</math> <!-- (k1 k-1) --> [ES] <math>\rightarrow</math> <!-- (k2) --> E+P
 
Como já referido, a formação de [ES] limita a velocidade da reacção, medida como V<sub>0</sub>:
 
:: V<sub>0</sub>=k<sub>2</sub>[ES]
 
Se [ES] fosse facilmente mensurável, o valor de k<sub>2</sub> seria simples de determinar directamente. No entanto, esse não é o caso, e o valor de [ES] tem de ser deduzido. Para tal, considere-se que a concentração do total de enzima presente na reacção, [E]<sub>t</sub>, é o somatório da concentração de enzima em complexo com o substrato, [ES], e da concentração de enzima "livre" (não ligada a substrato), [E]<sub>l</sub>:
 
:: [E]<sub>t</sub> = [E]<sub>l</sub> + [ES]
 
==Tratamento matemático e gráfico da equação de Michaelis-Menten==
 
== Tratamento matemático e gráfico da equação de Michaelis-Menten ==
Embora o gráfico obtido directamente da equação de Michaelis-Menten seja de interpretação relativamente simples, existem tratamentos matemáticos que simplificam a representação gráfica da equação e permitem a obtenção rápida de parâmetros cinéticos.
 
O tratamento mais conhecido e porventura mais utilizado é o de '''Lineweaver-Burk'''. A equação de Michaelis-Menten pode ser transformada numa equação da recta, do tipo y=ax+b:
 
:: <math>V_o=\frac{V_max [S]} {K_M + [S]}\Leftrightarrow \frac{1}{V_o}=\frac{K_M + [S]}{V_max [S]} \Leftrightarrow \frac{1}{V_o}= \frac{K_M}{V_max [S]} + \frac{[S]}{V_max [S]} \Leftrightarrow \frac{1}{V_o}=\frac{K_M}{V_max [S]} + \frac{1}{V_max}</math>
 
[[ImageImagem:Lineweaver-Burke plot.PNG|thumb|250px|Gráfico de Lineweaver-Burk.]]
Esta última forma da equação de Michaelis-Menten é conhecida como '''equação de Lineweaver-Burk'''. Um gráfico de <math>\frac{1}{V_o}</math> (y) em função de <math>\frac{1}{[S]}</math> (x) é uma recta de declive igual a <math>\frac{K_M}{V_max}</math> (a), que intercepta o eixo das coordenadas na origem no ponto <math>\frac{1}{V_max}</math> (b), interceptando também o eixo das abcissas no ponto <math>\frac{-1}{K_M}.</math>. Este gráfico é também chamado '''duplo recíproco''' pois trata-se de uma representação gráfica do recíproco de ambos os parâmetros V<sub>o</sub> e [S].
 
Este tipo de tratamento matemático permite uma determinação mais precisa de V<sub>max</sub>, um parâmetro que só se obtém por aproximação num gráfico de Michaelis-Menten.

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